Posted by on 19 kwietnia 2018

Utratę somatyczną heterozygotyczności i warianty liczby kopii zidentyfikowano jak opisano wcześniej19 (patrz rozdział Metody i Rys. S1 w Dodatku Dodatkowym). Utratę heterozygotyczności badano dalej w 7 guzkach i ich sparowanych leukocytach za pomocą analizy mikrosatelitarnej. DNA z pięciu guzków nadnerczy i ich sparowane próbki leukocytów zostały zsekwencjonowane przez Complete Genomics20 za pomocą rurociągu usługi Sekwencjonowania raka, wersja 2.0.2.26. Kolejne filtrowanie jest szczegółowo opisane w rozdziale Metody i na rysunku S2 w Dodatku uzupełniającym. Sekwencjonowanie Sanger powtórzeń Armadillo zawierające 5 (ARMC5) jest opisane w sekcji Metody w dodatkowym dodatku.
Transkryptomy 10 próbek nadnerczy od pacjentów z niezależnym od kortykotropiny makroskopowym przerostem kory nadnerczy były badane jak opisano wcześniej21 (patrz sekcja Metody w Dodatkowym dodatku).
Kultura komórkowa i transfekcja
Ludzkie komórki HeLa i komórki raka kory nadnerczy (H295R) hodowano, transfekowano i stymulowano forskoliną, jak opisano uprzednio. 22, 23 Mały interferujący RNA (siRNA) kierujący do ARMC5 i zastosowanego siRNA kontrolnego opisano w sekcji Metody w dodatkowym dodatku. . Wektor ekspresyjny ARMC5 zawierający znacznik FLAG (Origen RC226267) zastosowano do mutagenezy z zestawem Agilent Technologies 200521.
Analiza Western Blotting, Immunobarasing i Messenger RNA
Przygotowano lizaty całych komórek lub tkanki, analizę Western, analizę immunohistochemiczną i immunofluorescencję, jak opisano wcześniej 23, 24 (patrz sekcja Metody w dodatkowym dodatku).
Całkowity RNA wyekstrahowano z linii komórkowych, a poziomy ekspresji docelowych genów określono za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), jak opisano wcześniej23 (patrz sekcja Metody w dodatkowym dodatku). Stężenia kortyzolu w pożywce hodowlanej badano jak opisano wcześniej.15
Wyniki
Genotypowanie genów i sekwencjonowanie
Figura 1. Figura 1. Zmiany chromosomów w guzkach zidentyfikowanych za pomocą macierzy polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP). Panel A pokazuje liczbę pacjentów z niezależnym od kortykotropiny makronodularnym przerostem nadnerczy, którzy mieli zmianę chromosomów (zysk, stratę lub obojętną pod względem kopii utratę heterozygotyczności) w co najmniej jednym guzie. Najczęstsze zdarzenie, neutralna pod względem kopii utrata heterozygotyczności w 16p, wykryto u 7 z 26 pacjentów. Panel B pokazuje chromosom 16 z brodawki uzyskanej od Pacjenta 5 z obojętną pod względem kopii utratą heterozygotyczności w 16p. Górna część panelu pokazuje genotypy SNP wyrażone jako częstotliwość allelu B.
[patrz też: oczyszczanie organizmu, olej arganowy, olejek makadamia ]

Powiązane tematy z artykułem: oczyszczanie organizmu olej arganowy olejek makadamia

Posted by on 19 kwietnia 2018

Utratę somatyczną heterozygotyczności i warianty liczby kopii zidentyfikowano jak opisano wcześniej19 (patrz rozdział Metody i Rys. S1 w Dodatku Dodatkowym). Utratę heterozygotyczności badano dalej w 7 guzkach i ich sparowanych leukocytach za pomocą analizy mikrosatelitarnej. DNA z pięciu guzków nadnerczy i ich sparowane próbki leukocytów zostały zsekwencjonowane przez Complete Genomics20 za pomocą rurociągu usługi Sekwencjonowania raka, wersja 2.0.2.26. Kolejne filtrowanie jest szczegółowo opisane w rozdziale Metody i na rysunku S2 w Dodatku uzupełniającym. Sekwencjonowanie Sanger powtórzeń Armadillo zawierające 5 (ARMC5) jest opisane w sekcji Metody w dodatkowym dodatku.
Transkryptomy 10 próbek nadnerczy od pacjentów z niezależnym od kortykotropiny makroskopowym przerostem kory nadnerczy były badane jak opisano wcześniej21 (patrz sekcja Metody w Dodatkowym dodatku).
Kultura komórkowa i transfekcja
Ludzkie komórki HeLa i komórki raka kory nadnerczy (H295R) hodowano, transfekowano i stymulowano forskoliną, jak opisano uprzednio. 22, 23 Mały interferujący RNA (siRNA) kierujący do ARMC5 i zastosowanego siRNA kontrolnego opisano w sekcji Metody w dodatkowym dodatku. . Wektor ekspresyjny ARMC5 zawierający znacznik FLAG (Origen RC226267) zastosowano do mutagenezy z zestawem Agilent Technologies 200521.
Analiza Western Blotting, Immunobarasing i Messenger RNA
Przygotowano lizaty całych komórek lub tkanki, analizę Western, analizę immunohistochemiczną i immunofluorescencję, jak opisano wcześniej 23, 24 (patrz sekcja Metody w dodatkowym dodatku).
Całkowity RNA wyekstrahowano z linii komórkowych, a poziomy ekspresji docelowych genów określono za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), jak opisano wcześniej23 (patrz sekcja Metody w dodatkowym dodatku). Stężenia kortyzolu w pożywce hodowlanej badano jak opisano wcześniej.15
Wyniki
Genotypowanie genów i sekwencjonowanie
Figura 1. Figura 1. Zmiany chromosomów w guzkach zidentyfikowanych za pomocą macierzy polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP). Panel A pokazuje liczbę pacjentów z niezależnym od kortykotropiny makronodularnym przerostem nadnerczy, którzy mieli zmianę chromosomów (zysk, stratę lub obojętną pod względem kopii utratę heterozygotyczności) w co najmniej jednym guzie. Najczęstsze zdarzenie, neutralna pod względem kopii utrata heterozygotyczności w 16p, wykryto u 7 z 26 pacjentów. Panel B pokazuje chromosom 16 z brodawki uzyskanej od Pacjenta 5 z obojętną pod względem kopii utratą heterozygotyczności w 16p. Górna część panelu pokazuje genotypy SNP wyrażone jako częstotliwość allelu B.
[patrz też: oczyszczanie organizmu, olej arganowy, olejek makadamia ]

Powiązane tematy z artykułem: oczyszczanie organizmu olej arganowy olejek makadamia